牛結(jié)核分枝桿菌（Bovine Tuberculosis，BTB）抗體檢測試劑盒用于檢測牛血清中的牛結(jié)核分枝桿菌抗體，用于評估檢測由牛分枝桿菌引起的結(jié)核病的血清學(xué)輔助診斷。

本試劑盒采用間接ELISA法，在酶標(biāo)板條微孔上預(yù)包被牛結(jié)核分枝桿菌抗原。在試驗中，加入稀釋后的待檢血清，經(jīng)過溫育后，若樣品中含有牛結(jié)核分枝桿菌特異性抗體，則與包被板上的抗原結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其它成分后，再加入酶標(biāo)二抗，與檢測板上的抗原抗體復(fù)合物發(fā)生特異性結(jié)合，再經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的酶結(jié)合物，在微孔中加入TMB底物液，經(jīng)酶催化形成藍(lán)色產(chǎn)物，加入終止液終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀450nm波長測定反應(yīng)孔中的吸光度A值。

組份

需自備的設(shè)備及試劑

1.    微量移液器： 0.5μl-10μl、10μl-100μl、100μl-1000μl。

2.    一次性移液器吸頭。

3.    量筒：500ml。

4.    96孔板酶標(biāo)儀。

5.    蒸餾水或去離子水。

6.    洗瓶或洗板機。

樣品制備

取動物全血，按常規(guī)方法制備血清，要求血清清亮，無溶血。

洗滌液的準(zhǔn)備

濃縮洗滌液使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫，如有鹽結(jié)晶，搖動使結(jié)晶的鹽溶解，然后用蒸餾水或去離子水作10倍稀釋。稀釋好的洗滌液可在4℃存放一周左右。

樣品的稀釋

在血清稀釋板中按1：99的體積比稀釋待檢血清（例如：495μl樣品稀釋液中加5μl待檢血清）。

注意：陰性和陽性對照不用稀釋。取每個樣品后都要更換吸頭，準(zhǔn)確記錄每個樣品在板上的位置。每個樣品在加入到包被板微孔前應(yīng)充分混勻。

注意事項

1.    試劑盒使用前各試劑應(yīng)平衡至室溫，使用前應(yīng)搖勻，使用后放回2-8℃。

2.    不同品種、不同批號試劑盒的試劑組分不得混用，使用試劑時應(yīng)防止試劑污染。

3.    底物和終止液對皮膚和眼可能有刺激性，使用時應(yīng)該注意防護。

4.    TMB（顯色液）不要暴露于強光和避免接觸氧化劑。

5.    檢測板拆封后應(yīng)避免受潮或沾水(未用完的抗原包被板加干燥劑放于自封袋中，并盡快置于2-8℃)。

6.    所有廢棄物在丟棄之前應(yīng)合理處理以免污染。

7.    嚴(yán)格遵守操作說明可以獲得最好的結(jié)果。操作過程中移液、定時和洗滌等的全部過程必須精確。

8. 血清稀釋板為一次性用品，不得重復(fù)使用；血清稀釋板的最大容量為300μl/孔。

操作步驟

1.    取預(yù)包被的檢測板（根據(jù)樣品多少，可拆開分次使用），將稀釋好的待檢血清取100μl加入到檢測板孔中。同時設(shè)陰性對照1孔，陽性對照2孔，取陰性及陽性對照各100μl分別加入反應(yīng)孔中輕輕振勻孔中樣品（勿溢出）。

2.    蓋上封板膜（可按實際需要自行裁剪），置37℃溫育30分鐘。

3.    小心揭開封板膜，甩掉板孔中的溶液，使用工作濃度洗滌液每孔加250ul，后甩去孔內(nèi)液體，以上步驟重復(fù)4-6次，最后在干凈吸水紙上拍干。

4.    每孔加酶結(jié)合物100μl，蓋上封板膜，置37℃溫育30分鐘。

5.    小心揭開封板膜，甩掉板孔中的溶液，洗滌4-6次, 方法同3。切記最后在干凈吸水紙上拍干。

6.    每孔加顯色液100μl，輕微震蕩混勻、蓋上封板膜37℃閉光顯色10分鐘。

7.    每孔加終止液50μl，使反應(yīng)終止，10分鐘內(nèi)測定結(jié)果。

結(jié)果判定

用酶標(biāo)儀于450nm（630nm作參比波長）讀取吸光度OD值。

試驗成立的條件是：

陰性對照（N）OD值<0.2，同時陽性對照（P）OD值〉0.4。

計算方法：

樣品OD值÷陽性對照OD均值= S/P值

陰陽性判斷：

S/P<0.3判為陰性;

S/P≥0.3判為陽性。

有效期

貯存方法： 2 - 8oC下貯存。

有效期： 12個月。