【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：禽流感病毒（通用型）RT-PCR檢測(cè)試劑盒

英文名稱：Avian Influenza virus RT-PCR Detection Kit

【包裝規(guī)格】10T/盒 & 50T/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于禽流感病毒檢測(cè)，不進(jìn)行病毒分型，對(duì)禽流感病毒引起的流感及其并發(fā)癥的診斷及療效評(píng)估有重要指導(dǎo)意義。

【檢驗(yàn)原理】

利用離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜提取RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以RNA為模板，以引物為起點(diǎn)合成與RNA模板互補(bǔ)的cDNA鏈。在TaqDNA聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火、中溫延伸的循環(huán)，使特異DNA片段的拷貝數(shù)放大一倍。經(jīng)過(guò)35次循環(huán)，最終使擴(kuò)增DNA片段放大了數(shù)百萬(wàn)倍。將擴(kuò)增DNA片段進(jìn)行電泳，經(jīng)染色后，在紫外燈照射下，肉眼可見到DNA片段的擴(kuò)增帶。

【主要組成成份】

注：陰性對(duì)照為禽類基因組DNA，陽(yáng)性對(duì)照為失去活性的禽流感病毒cDNA。

【儲(chǔ)存條件及有效期】-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個(gè)月。

【需自備的物品】

1.儀器：分析天平、離心機(jī)、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀（或紫外分析儀）、微波爐、-20 ℃冰箱、可調(diào)移液器（2 μL、20 μL、200 μL、1000 μL）。

2.耗材：眼科剪、眼科鑷、稱量紙、20 mL一次性注射器、生理鹽水、瓊脂糖、500 mL量筒、500 mL錐形瓶、經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）水處理的滅菌1.5mL離心管和吸頭（10 μL、200 μL、1000 μL）、滅菌雙蒸水。

【注意事項(xiàng)】

1.病毒具有很強(qiáng)的感染能力，操作前必須準(zhǔn)備好各種防御措施。

2.操作時(shí)須嚴(yán)格按照步驟進(jìn)行，廢物必須放入含消毒液的廢物缸，以免污染實(shí)驗(yàn)室和工作人員。

3.為避免其他核酸的污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性，必須使用不含DNA和RNA的離心管、吸管、槍頭、試劑和手套，操作人員須戴口罩。

4.Buffer V-L、Buffer V-N和Buffer W1A含刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套和眼鏡，避免沾染皮膚、眼睛和衣服，謹(jǐn)防吸入口鼻。

【實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備】

第一次使用時(shí)，請(qǐng)?jiān)?/span>Buffer W1 A和Buffer W2 concentrate中按試劑瓶上指定的體積加入無(wú)水乙醇；

準(zhǔn)備異丙醇（1%冰乙酸）：即99ml異丙醇中加入1ml冰乙酸，混合均勻，室溫密閉儲(chǔ)存；

如果是提取病毒RNA，請(qǐng)選用RNase free Tip槍頭和1.5 ml離心管或?qū)岊^和離心管用0.1% DEPC水處理后再使用。

【操作步驟】

樣本采集：采用鼻拭子、咽拭子等方法獲得樣本。具體操作方法如下：

（1）鼻拭子： 操作者將沾濕的無(wú)菌拭子平行于上腭的角度輕輕地左右轉(zhuǎn)動(dòng)從一側(cè)鼻孔插入至鼻道內(nèi)鼻腭處，一般當(dāng)拭子插入有阻力時(shí)再將拭子停留2～3s后緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)退出。

（2）咽拭子：操作者一手持壓舌板壓住病人舌后根，另一手拿住無(wú)菌拭子根部，然后將沾濕的無(wú)菌拭子左右兩面及拭子頭部快速且較用力地分別刮取扁桃腺兩側(cè)及咽后壁的分泌物。

（3）將鼻拭子和咽拭子一起放人盛有1.0ml生理鹽水的離心管中備用。

2. 樣品處理：每份樣品分別處理。

（1）無(wú)細(xì)胞體液樣品處理：收集200 μL樣品，轉(zhuǎn)入到1.5 ml離心管中；

（2）全血樣品處理：待血凝后取血清 200 μL , 轉(zhuǎn)入到1.5 ml離心管中；

（3）組織樣品處理：每份組織分別從三個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g ，用手術(shù)剪碎混勻后取 ，用手術(shù)剪碎混勻后取 0.05 g于研磨器中，加入1.5 mL生理鹽水繼續(xù)充分研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5 mL 滅菌離心管中，12,000 rpm離心 5 min，取上清液 200 μL 于1.5 mL離心管中。

3. 提取過(guò)程：

（1）向上一步轉(zhuǎn)入樣品的1.5 mL的離心管中，加入200 μL Buffer V-L，渦旋振蕩混合均勻，靜置5 min。

（2）加入75 μL Buffer V-N，渦旋振蕩混合均勻后，于12,000 rpm離心5 min。

（3）將上清液轉(zhuǎn)移到新的2mL離心管（試劑盒內(nèi)已提供）中，加300 μL異丙醇（1%冰乙酸），上下倒置6-8次，混合均勻。

（4）將制備管置于2ml離心管（試劑盒內(nèi)提供）中，取上一步驟中的混合液移入制備管中，6,000 rpm離心1 min。

（5）棄濾液，將制備管放回到2 ml離心管中，加入500 μL Buffer W1A（確認(rèn)已按要求加入無(wú)水乙醇），室溫靜置1min，于12,000rpm離心1 min。

（6）棄濾液，將制備管放回到2 ml離心管中，加入800 μL Buffer W2（確認(rèn)已按要求加入無(wú)水乙醇），于12,000 rpm離心1 min。

（7）將制備管放回到2 ml離心管中，12,000 rpm離心1 min。

（8）將制備管置于潔凈的1.5 ml離心管（試劑盒內(nèi)已提供）中，在制備管膜中央加入40-60 μL Buffer TE（nuclease-free），室溫靜置1min，于12,000rpm離心1-2min洗脫DNA/RNA。

注：洗脫體積越大，洗脫效率越高。如果需要DNA/RNA濃度較高，可以將洗脫的DNA/RNA再次過(guò)柱離心洗脫一次；或適當(dāng)減少洗脫體積， 但是最小體積不應(yīng)少于30 μl，體積過(guò)小降低洗脫效率，減少RNA產(chǎn)量。

4. RT-PCR擴(kuò)增

每份總體積20 μL，含15 μL RT-PCR反應(yīng)液（用前混勻），3μL 混合酶液，2 μL模板RNA。

例如：n份樣品，配制n+1份，15×（n+1）RT-PCR反應(yīng)液， 3×（n+1）混合酶液勻后取18 μL分裝成n份，分別加入2 μL模板RNA，作好標(biāo)記。

在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行以下程序：50 ℃ 10 min，94 ℃ 3 min；循環(huán)94℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35次；再72 ℃延伸7 min。

5. 電泳

稱1.5 g瓊脂糖放于500 mL錐形瓶中，加入50倍稀釋的TAE電泳緩沖液100 mL（取2 mL 50倍TAE電泳緩沖液，用雙蒸水稀釋至100 mL），于微波爐中熔解，再加入50 μL染色液混勻。在電泳槽內(nèi)放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中，以110～120V電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。

【結(jié)果判定】

陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)219 bp擴(kuò)增帶、陰性對(duì)照無(wú)帶出現(xiàn)（引物帶除外）時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)219 bp擴(kuò)增帶為禽流感病毒陽(yáng)性，否則為陰性。